Medicina / Ciências Médicas e da Saúde

Dissertações de Mestrado

 

Dismútases do anião Superóxido nas células do cumulus oophorus humanas

 

Autor: Liliana Raquel Casais de Matos
Orientador: Henrique de Almeida

 

Mestrado em Medicina e Oncologia Molecular

Faculdade de Medicina

Universidade do Porto
 

 

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Dismútases do anião Superóxido nas células do cumulus oophorus humanas

Resumo

As técnicas de Procriação Medicamente Assistida (PMA), enquanto meios terapêuticos da infertilidade, possuem uma eficácia ainda aquém do desejável, por limitações técnicas, e associadas à qualidade de gâmetas e embriões. Dada a impossibilidade de analisar o ovócito sem o inutilizar, a avaliação do seu meio envolvente poderá auxiliar na previsão da sua qualidade. Admite-se que as células do cumulus oophorus (CCO), pela sua relação íntima e persistente com o ovócito, influenciam a sua qualidade e capacidade de fertilizar. Uma das acções exercidas será proteger o ovócito contra danos causados pelas espécies reactivas de oxigénio. O stress oxidativo está envolvido em processos fisiológicos e patológicos da reprodução, mas é incerto o mecanismo que medeia a sua intervenção, bem como o papel que exercem os diferentes intervenientes (oxidantes e antioxidantes). Um destes é a enzima Dismútase do anião Superóxido, em particular as suas isoformas intracelulares, o que leva a formular a hipótese de ela contribuir para o efeito protector do ovócito exercido pelas CCO no ser humano; nesse âmbito, poderá vir a tornar-se um factor preditivo do sucesso da PMA. Para verificar a hipótese, começou-se por optimizar as condições de cultura dessas células e estudaram-se a actividade e expressão da enzima em diferentes situações clínicas de infertilidade. As CCO humanas utilizadas foram obtidas durante os procedimentos de PMA
realizados por indicação clínica. Células provenientes de pacientes diferentes foram colocadas em cultura e posteriormente processadas para detecção por imunocitoquímica das isoformas CuZnSOD e MnSOD. A actividade da SOD foi quantificada nas diferentes colheitas e relacionada com os factores de infertilidade e idade das respectivas pacientes e os teores de CuZnSOD e MnSOD foram quantificados, por Western blotting em homogeneizados de CCO. Em cultura, as CCO aderem, formam extensões citoplasmáticas e depois proliferam, mantendo-se activas por um período de tempo até 15 dias. Tanto a CuZnSOD como a MnSOD foram detectadas em todas as células em cultura. A actividade da SOD, nas CCO, diminui com o envelhecimento reprodutivo. Além disso, está aumentada em pacientes com endometriose ou disfunção ovulatória, e diminuída em pacientes com infertilidade de causa tubária quando comparada com a actividade das CCO recolhidas de mulheres controlo (infertilidade de causa masculina). A cultura de CCO mostra que é possível utilizá-las para melhor conhecer mecanismos moduladores da reprodução humana. As alterações encontradas na actividade e teor das isoformas da SOD, indicam que o stress oxidativo é um interveniente importante na reprodução humana e na sua patologia. Os seus moduladores devem por isso ser considerados marcadores potenciais de predição de sucesso em PMA.

 

Índice

ÍNDICE GERAL
ÍNDICE DE ILUSTRAÇÕES
LISTA DE ABREVIATURAS
RESUMO
SUMMARY

INTRODUÇÃO

1. O ovário humano

1.1. Anatomia

1.2. Ciclo menstrual
1.3. Oogénese e composição da reserva ovárica
1.4. Desenvolvimento folicular

1.4.1. Aspectos morfológicos

1.4.2. Regulação do crescimento folicular

1.4.3. Crescimento e maturação ovocitária

1.5. Cumulus Oophorus

2. Procriação Medicamente Assistida

2.1. Infertilidade

2.2. Técnicas de Procriação Medicamente Assistida

2.3. Eficácia da aplicação das técnicas de PMA

3. Stress Oxidativo

3.1. Espécies Reactivas de Oxigénio

3.2. Antioxidantes
3.3. Influência na Reprodução

4. Objectivos

MATERIAL E MÉTODOS

1. Recolha e obtenção de células de cumulus oophorus
2. Cultura primária de células

2.1. Imunocítoquímica para detecção de CuZnSOD e MnSOD

3. Morfologia Ultra-estrutural

4. Estudos Bioquímicos

4.1. Avaliação da viabilidade celular e contagem das células

4.2. Obtenção de homogeneizados

4.3. Quantificação da actividade da SOD

5. Análise Molecular

5.1. Preparação das amostras para SDS-PAGE

5.2. SDS-PAGE

5.3. Western blotting

6. Análise Estatística

RESULTADOS

I. Número de células e viabilidade celular
II. Caracterização das culturas primárias de células de cumulus oophorus
III. Estudo ultra-estrutural
IV. Imunodetecção das enzimas CuZnSOD e MnSOD

V. Quantificação da actividade da SOD

VI. Detecção e quantificação da CuZnSOD e MnSOD

DISCUSSÃO

CONCLUSÕES

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

COMUNICAÇÕES ASSOCIADAS AO PRESENTE TRABALHO
 

 

Trabalho completo